鉴于需要扩大诊断检测，已迅速开发了许多用于医疗和公共用途的COVID-19即时检测方法。然而，检测方法的发展速度有时超过了严格的评估，这些试剂盒的准确性和可靠性仍然存在不确定性。这篇文章解释了快速护理点(PoC)测试的需求，围绕可靠性和验证的问题，以及试剂的选择如何影响诊断性能。
诊断的作用
自2019年底出现以来，严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)已蔓延到200多个国家，感染了1200多万人，在全球造成至少50万人死亡(1)。虽然感染病死率相对较低(估计约为1%)(2))， SARS-CoV-2已被证明是一种能力很强的病原体，潜伏期长，传播率高，而且无症状到轻度感染的比例很高，这使得检测和控制具有很高的挑战性。就目前而言，除了少数仅限于最严重病例的研究性治疗方法之外，没有疫苗或特定的治疗方法。因此，非药物干预措施已成为疾病预防的主要手段，包括自我隔离、旅行隔离、保持社交距离和个人防护装备。尽管实施了这些措施，但许多国家准备不足，因此面临着持续的社区和医院传播。为了通过接触者追踪将传播减少到可控制的水平并遏制进一步暴发，从诊断检测中获得的信息将至关重要。这些数据不仅可以识别、隔离和治疗病例，而且还提供了流行病学变量，为区域和国家一级公共卫生政策的持续变化提供信息。
到目前为止，SARS-CoV-2诊断的主要手段是聚合酶链反应(PCR)，该技术将少量病毒RNA扩增到可检测的水平，以确认存在活动性感染。自大流行早期以来，PCR一直有助于诊断病例，并显示出其在速度和诊断敏感性方面的优势，因为拭子可在几小时内送到临床实验室提供结果，而且只需要非常少量的RNA即可扩增。然而，检测病毒RNA的需求也是该技术的主要缺点:当我们的身体开始控制感染时，病毒很快就会被排出体外，其RNA很快就无法检测到(3)。因此，检测的时间窗口有限，对无症状或亚临床感染的诊断尤其具有挑战性。另一个主要问题在于样本采集:由于痰中的病毒载量分布不均匀，总有可能没有捕获到病毒RNA，这可能导致假阴性结果，从而产生潜在的有害后果(4)。最后，还有一些实际的限制需要考虑:RNA样本的处理需要专门的生物控制实验室，并由复杂且资源昂贵的样本收集和分配系统支持，通常会延长周转时间超过24小时(5)。综合起来，这些因素限制了PCR的实用性，使其无法大规模使用。
转到护理点
为了加强社区一级的诊断能力和更好地跟踪病例，PoC需要使用更加分散、快速和“少资源”的检测形式。此外，可以检测SARS-CoV-2抗体的平台非常可取，因为它们在流行病学建模、分配所谓的“免疫护照”以及识别可以提供治疗性血浆的恢复期患者方面具有潜力。虽然有多种方法可供选择，但最适合满足这些需求的技术之一是横向流量分析(LFAs;简而言之，LFAs是一种基于纸或聚合物的免疫分析方法，它吸收样本并沿着衬垫表面运行，结合报告抗体，然后检测抗体，以产生确认的视觉信号——通常在几分钟内(6)。LFA的一个著名例子是家用验孕棒。
图1所示。LFA的基本设计。lfa通常包括一个塑料盒，包含一条能够吸收和运输分析物的吸收材料。1)分析物首先被添加到条带的一端，在那里它被吸收，允许分析物沿着它迁移。2)被分析物遇到一个结合抗体区域，结合抗体附着在被分析物上，以及可检测的标签。3)被分析物继续迁移到特定于被分析物的测试抗体区域，并结合产生一条可见的实线，表明结果为阳性，因此确认感染。二级控制线用于检测迁移的偶联抗体，并确保测试正常工作。
LFA平台的一个特别有用的特性是其设计的灵活性，使其非常适合不同的应用程序。为了检测急性SARS-CoV-2感染，可以从鼻咽拭子样本中收集病毒或抗原，并用针对刺突(S)和核蛋白(N)的特异性抗体进行检测。此外，还可以从痰液(IgA)或血液(IgM和IgG)中测量针对SARS-CoV-2产生的一系列不同抗体，以评估患者在感染期间和感染后很长一段时间内的免疫状态。然而，与抗原或RNA不同，大多数COVID-19患者的抗体出现异常缓慢，IgM和IgG的中位时间分别为11天和14天(7)(图2)。
图2。说明SARS-CoV-2感染时间过程中RNA、抗原、IgM和IgG一般水平的图表。
因此，抗体测试在急性期诊断中的应用仍不确定，公共卫生机构已建议不要在指导医疗保健中使用LFAs，而是建议将其与其他诊断技术或在人群水平的流行病学研究中联合使用(8)。另一方面，快速抗原检测在分散急性期检测中显示出潜力，特别是在PCR方法有限的情况下。鉴于这些互补的特点，结合使用抗体和抗原lfa可以提供急需的血清学数据，同时减轻公共检测实验室的压力。安全确认抗体状态将使个人能够重返工作岗位并指导决策者，而急性期状态可用于为隔离和治疗决策提供信息，可能与追踪感染的数字方法结合使用。
优先考虑质量
SARS-CoV-2的出现及其在全球的扩散，促使诊断设备制造商做出了前所未有的努力，以提供及时有效的解决方案。在撰写本文时，有200多种快速检测方法正在开发或已经商业化使用(图3)，其中许多用于中小型血清学研究(9)。
图3。饼图显示正在开发或商业化的快速检测方法的比例以及基于抗原或抗体的比例。数据来自创新诊断基金会(FIND)(9)。
然而，尽管现在有大量的测试可用，但有效部署这些测试还存在几个障碍。首先，由于诊断方法的开发速度前所未有，许多试剂盒的性能特征尚未得到充分评估，以供PoC使用。其结果是出现了大量低质量的诊断产品，可能会危及患者，浪费稀缺资源，并损害公众对医疗服务的信任。更复杂的是，少数评估此类测试表现的研究表明，评估标准存在很高的偏倚和异质性风险(10)，进一步的临床调查往往显示不太有利的表现，一些测试甚至被发现有“虚假的文件、不完整的技术文件或未经证实的说法”。(11)。最后，在抗体测试的情况下，对抗体动力学和免疫保护的相关因素仍不完全了解，这限制了LFAs在这一应用中的实用性(12)。为了解决这些问题，进一步的研究和分析验证是一个明确的优先事项。特别是，需要对包括一系列年龄和种族的预期使用人群进行前瞻性队列研究，并透明地报告数据。
试剂的作用
虽然lfa看似简单，但其开发过程却相当复杂。一种检测方法的设计、优化和验证一次可能需要数年时间，开发人员通常会在初步批准后继续改进性能特征，以降低假阳性和阴性结果的风险。检测性能的核心是高质量生物试剂的开发、选择和应用。几乎所有的免疫分析都使用细胞培养表达的重组蛋白，这提供了提高生物安全性和批与批一致性的优势(13)。对于COVID-19，几乎所有的测试都基于两种抗原:SARS-CoV-2 S和N。
S蛋白(图4)是一种从SARS-CoV-2表面突出的三聚体，并使其具有典型的冠状外观。除了它的三个多肽链外，每个三聚体包含多达66个糖基糖，这些糖基糖在感染期间被翻译后添加，以介导各种功能(14)。
图4。SARS-CoV-2 S蛋白三聚体的三维晶体结构。通用电气罐头是红色的;氨基酸是蓝色的。结构由Walls等决定艾尔。(15)。RCSB #: 6基金。
从检测发展的角度来看，这些聚糖构成了许多被宿主抗体识别的关键表面表位，因此，使用未糖基化的S蛋白有可能与非特异性的交叉反应性抗体结合，从而降低诊断特异性。为了确保重组S蛋白具有完整的糖基化模式和适当的构象折叠，开发人员必须谨慎选择和优化他们的表达系统。更简单的生物，比如大肠杆菌例如，美国没有必要的细胞机制糖基化重组抗原，需要更先进的系统，如哺乳动物或昆虫细胞系。在扩大蛋白质生产时，也需要仔细考虑产量和批次间一致性等因素。为了进一步提高特异性，许多制造商还使用S蛋白的特定区域，这些区域与其他冠状病毒的遗传变异更大，因此不太能够结合交叉反应抗体。流行的选择是S1亚基S和它的受体结合域，负责结合血管紧张素转换酶2 (ACE2)介导病毒进入。然而，这反过来又带来了新的挑战，因为生产和呈现这些被截断的蛋白质在它们的原生构象不是一件容易的事情。
对于使用N的分析，挑战有些不同。N不存在于病毒表面，而是存在于病毒衣壳内，在那里它们与基因组RNA结合。与S不同，N完全没有糖基化，在不同冠状病毒之间表现出更强的遗传序列保守性，特别是在其N端结构域。由此产生的结构相似性允许N结合有可能产生假阳性结果的交叉反应性抗体。为了解决这个问题，一种流行的策略是通过在N基因中引入点突变来“消融”交叉反应性表位，同时尽量减少其他区域的结构变化。或者，可以引入所谓的“猝灭抗原”来“吸收”患者血清中多余的交叉反应抗体。
SARS-CoV-2诊断检测的平衡方法
如何在提高诊断能力的需要和诊断错误的风险之间取得平衡，仍然是公共卫生面临的一项重大挑战。为了实现广泛检测的承诺，开发人员必须非常小心地设计和验证基于抗原和抗体的分析方法，并仔细考虑关键试剂。
最初发表于2020年8月的《临床研究杂志》:https://bit.ly/33ItEAy
参考文献
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